Niezmienne naturalne komórki T zabójcy w astmie i przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc czesc 4

Tylko niewielki procent komórek był naprawdę pozytywny w testowaniu za pomocą V.11 lub z tetramerami CD1d obciążonymi .Gal (Panel F). Nieswoiste wiązanie przeciwciał z receptorami Fc. zablokowano 2 mg na mililitr poliklonalnej ludzkiej IgG (Sigma). Początkowo dublety komórkowe, które mogły zawierać komórki adherentne (np. Makrofagi) i martwe komórki, a zatem mogły wiązać przeciwciała niespecyficzne, zostały wykluczone podczas bramkowania za pomocą szerokości i obszaru impulsu (Figura i Fig. E1 w Dodatku Uzupełniającym) . Martwe komórki zostały następnie wyłączone na podstawie ich wybarwienia ze środkiem wiążącym DNA jodkiem propidyny (rysunek i rysunek E2 w dodatkowym dodatku). Duże komórki i szczątki zostały wykluczone na wykresie rozproszenia przedniego i bocznego (rysunek 1). Komórki T CD3 + bramkowano dodatnio na podstawie ich wybarwienia przeciwciałem anty-CD3 sprzężonym z allofikocyjaniną, barwnikiem fluorescencyjnym, który emituje światło o długości fali przekraczającej zakres autofluorescencyjnych komórek (makrofagi). Zgodnie z oczekiwaniami, te komórki CD3 + znaleziono w wąskiej grupie komórek o małej ziarnistości (czarne kropki lub komórki) (Figura i Fig. E1 w Dodatku Uzupełniającym). Ostatecznie limfocyty T CD3 + CD4 + bramkowano na podstawie ich wybarwienia przeciwciałem anty-CD4. (Strategia bramkowania jest opisana szczegółowo na rys. E1 do E6 w Dodatku uzupełniającym).
Ilościowa, real-time PCR
Użyliśmy sond oligonukleotydowych do PCR w czasie rzeczywistym genów kodujących V.24 (TRAV10, zgodnie z nomenklaturą systemu informacji międzynarodowej IMMT) i V.11 (TRBV25-1), jak również sond do wykrywania ekspresji receptor komórkowy (gen TRBC2) (PrimerDesign). Startery zestawiono z innymi regionami zmiennymi, aby potwierdzić, że nie było znaczącej homologii z żadnym innym regionem zmiennym (w przypadku zestawów do wykrywania starterów, patrz Dodatek dodatkowy).
Wyniki
Analiza Lavagealveolar-Lavage
Tabela 1. Tabela 1. Komórki T w ludzkich drogach oddechowych. Ryc. 2. Rycina 2. Barwienie komórek Lavanda-pęcherzyków płucnych od pacjenta z astmą w celu wykrycia niezmiennych naturalnych komórek T zabójcy. Komórki zabarwiono za pomocą tetrameru CD1d obciążonego .-galaktozyloceramidem (.Gal) i przeciwciałem 6B11 dla regionu 3 determinującego komplementarność domeny V.24-J.18 receptora komórek T, oprócz standardowego zastosowania R przeciwciało skoniugowane z przeciwciałem anty-V.24 i izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) skoniugowane z przeciwciałem anty-V.11. Analizę oparto na bramkowaniu limfocytów T CD3 + (panel A). Przeciwciała skoniugowane z R-fikoerytryną (6B11) i skoniugowane z R-fikoerytryną tetramery CD1d obciążone .Gal nie wykryły niezmienionych komórek T naturalnego NK (iNK) w próbce płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) (Panel B). Jako pozytywna kontrola do wykrywania limfocytów T iNK, próbka była wzbogacona komórkami z klonu komórek T iNK (Panel C). Za pomocą zasad bramkowania (ryc. 1) wykryto limfocyty T iNK w wzbogaconej próbce, potwierdzając działanie zarówno przeciwciał, jak i strategii bramkowania (panel C).
Tabela 2. Tabela 2. Niezmienne naturalne komórki T zabójcy w ludzkich drogach oddechowych. Tabela 3. Tabela 3. Całkowita i różnicowa liczba komórek w próbkach z pęcherzykowo-pęcherzykowatocznikowego
[patrz też: osrodki leczenia alkoholizmu, excedrin migrastop, rumia dentysta ]