Niezmienne naturalne komórki T zabójcy w astmie i przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc cd

Próbki pobrane z biopsji oskrzeli natychmiast rozprowadzono za pomocą kolagenazy I (Sigma) odtworzonej w RPMI 1640 bez L-glutaminy (Cambrex) przy mg na mililitr w ciągu godziny w 37 ° C (98,6 ° F). Analiza fenotypowa
Ekspresję na komórkach niezmiennego naturalnego receptora limfocytów T zabójca wykrywano na cytometrii przepływowej przy użyciu siedmio-kolorowego sortera komórek FACSAria (BD Biosciences), stosując następujące monoklonalne przeciwciała w połączeniu z monoklonalnymi anty-CD3 i anty-CD4. przeciwciała (BD Biosciences): przeciwciało monoklonalne anty-V.24 skoniugowane z R-fikoerytryną, monoklonalne przeciwciało monoklonalne anty-V.11 (Immunotech) skoniugowane z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), sprzężone z R-fikoerytryną tetramery CD1d obciążone .-galaktozyloceramidem i R-fikoerytryną skoniugowane przeciwciało monoklonalne 6B11 skierowane przeciw regionowi determinującemu komplementarność 3 receptora limfocytów T V.24-J.18 niezmiennych komórek T naturalnego zabójcy (BD Biosciences).
Figura 1. Figura 1. Analiza ekspresji w komórkowej powierzchni niezmiennego receptora komórek T naturalnego zabójcy w komórkach Lavo-pęcherzykowatych otrzymanych od pacjentów z astmą. Komórki z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) oddzielono od fazy płynnej i wybarwiono przeciwciałami monoklonalnymi dla CD3 (sprzężony allofikocyjanina), CD4 (Cy5.5 sprzężony z chlorofilem perydynina [PerCP]), V.11 (izotiocyjanian fluoresceiny [FITC] – skoniugowany) i tetramery CD1d obciążone .-galaktozyloceramidem (.Gal) (sprzężonym z R-fikoerytryną) i jodkiem propidyny (PI), który wiąże się z DNA. Komórki analizowano za pomocą 7-kolorowej cytometrii przepływowej (sorter komórek FACSAria, BD Biosciences). W każdym panelu, wykresy po lewej stronie pokazują sekwencję bramkowania stosowaną do wybrania różnych populacji komórek na podstawie właściwości komórek (np. Szerokość impulsu i obszar tętna, wielkość komórki i ziarnistość) i barwienia dla przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z barwnikami; wykresy po prawej stronie pokazują odpowiednią wybraną populację komórek wybarwioną na niezmienne markery komórek T zabójcy naturalnego (iNK) (np. komórki podwójnie dodatnie dla tetramerów V.11 i CD1d obciążonych .-galaktozyloceramidem [.Gal] wyrażone jako procent bramkowanej komórki populacja analizowana na działce pokazanej po lewej stronie). Linie pionowe i poziome wyznaczają ćwiartki definiujące poziomy fluorescencji przypisywane kombinacji fluorescencji tła komórek, które nie były barwione przeciwciałem ani barwione przeciwciałem kontrolnym o tym samym izotypie co przeciwciało wykrywające. Wszystkie komórki przed bramkowaniem pokazano w Tablicy A. Dublety komórek wyłączano z populacji singletowej (Panel B), a martwe komórki wykluczano na podstawie ich wybarwiania PI (Panel C). Komórki jednojądrzaste bramkowano zgodnie z rozmiarem i ziarnistością odpowiednio w rozproszeniu w przód (FSC) i rozproszeniu bocznym (SSC) (panel D). Pomocnicze lub indukujące limfocyty T CD4 + bramkowano następnie za pomocą połączenia przeciwciał anty-CD3 (Panel E) i anty-CD4 (Panel F). Seryjne bramkowanie zmniejsza liczbę komórek, które można pomylić z komórkami T iNK na podstawie ich pozornie pozytywnego wybarwienia dla domeny receptora komórek V.11 i tetramerów CD1d obciążonych .-Gal (barwienie wykazało zmniejszenie liczby widocznych komórki T iNK, od 32% do mniej niż 1%)
[hasła pokrewne: jaka rasa psa dla dziecka, olx węgrów, stomatolog pruszków ]