Niezmienne naturalne komórki T zabójcy w astmie i przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc ad 5

Wstępne analizy cytometrii przepływowej dla niezmiennych komórek T zabójcy naturalnego wykonano na próbkach płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego uzyskanych od pacjentów z astmą, umożliwiając bezpośrednie porównanie z wcześniejszymi badaniami niezmienniczych komórek T naturalnych zabójców w astmie4 i sarkoidozie. 16 Analiza uzyskanych próbek spośród 11 osób z astmą (3 z łagodną astmą i 8 z umiarkowanie ciężką astmą) z użyciem przeciwciał monoklonalnych V.24 i V.11, które wykryły wszystkie niezmienne komórki T naturalnych zabójców, 8-10 wykazało, że niezmienne komórki T zabójcy naturalnego stanowią mniej niż 2% komórki CD3 + i mniej niż 1,5% komórek CD3 + CD4 + (Tabela 1). Podobne liczby uzyskano, gdy stosowaliśmy tetramery CD1d obciążone .-galaktozyloceramidem 17 lub przeciwciałem monoklonalnym 6B11 (Figura i Figura 2 i Tabela 2). Rutynowa całkowita i różnicowa liczba komórek w płucach oskrzelowo-pęcherzykowych jest pokazana w Tabeli 3. Rycina 3. Rycina 3. Analiza cytometrii przepływowej próbek pobranych na indukcję plwociny i biopsję oskrzeli. Spośród komórek T CD3 + CD4 + z plwociny uzyskanych od osobnika z astmą, kontrolą i osobnika z POChP i leczonego ditioerytrytem, 0 do 1,3% komórek T barwiono dla obu domen V.24 i V.11, a zatem określono jako niezmienne komórki T naturalnego zabójcy (panel A). Do analizy komórek T CD3 + z błoną śluzową oskrzeli uzyskanych od reprezentatywnego osobnika z umiarkowanie ciężką astmą, próbki oskrzelowo-biopsyjne traktowano kolagenazą w celu zdyspergowania komórek i komórki następnie inkubowano z przeciwciałami dla CD3, V.24 i V.11 (Panel B). Martwe komórki zostały wykluczone, a bramkowanie dodatnie przeprowadzono dla komórek jednojądrzastych i komórek CD3 +. Martwe komórki są czerwone, a żywe komórki są zielone. Nie było niespecyficznego wybarwiania, jak wykazano przez przeciwciało kontrolne izotypu IgG1, ale nie było również dodatniego wybarwiania niezmiennych komórek T zabójcy naturalnego. Barwienie z użyciem tetramerów CD1d obciążonych .-galaktozyloceramidem (.Gal) i przeciwciałem monoklonalnym 6B11 potwierdziło wynik. Próbki uzyskano od dwóch osobników z łagodną astmą i pokazano wyniki barwienia przeciwciałami przeciwko V.24 i V.11. FITC oznacza izotiocyjanian fluoresceiny, jodek propidyny PI, charakterystykę rozproszenia do przodu FSC i charakterystykę rozproszenia bocznego SSC.
Aby stworzyć kontrolę pozytywną do wykrywania niezmiennych komórek T naturalnych zabójców w komórkach z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą cytometrii przepływowej, wzbogaciliśmy próbkę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego komórkami z niezmiennego klonu komórek T o zabijaczu naturalnym (w celu walidacji komórki klon, patrz ryc. E7 w Dodatku Uzupełniającym). Stosując zasady bramkowania przedstawione na Rysunku i Rysunku 2, wykryliśmy niezmienne komórki T zabójcy naturalnego w wzbogaconej próbce, z liczbami względnymi (odsetki wszystkich komórek T CD3 +) odpowiadającymi liczbie dodanych niezmiennie naturalnych komórek T zabójcy (Figura 3). ). Potwierdziło to zdolność zarówno wykorzystywanych przeciwciał, jak i strategii bramkowania do wykrywania niezmienniczych komórek T naturalnych zabójców. Dalsze fenotypowanie komórek CD3 + CD4 + wykazało, że tymi komórkami są głównie aktywowane komórki T pamięci eksprymujące CD69 i CD45RO (Fig. E8 w Dodatku Aneks).
Analiza plwociny
Następną analizę niezmiennych komórek T zabójcy naturalnego przeprowadzono na komórkach dróg oddechowych uzyskanych metodą indukcji plwociny14, co pozwoliło nam na badanie większej liczby osobników niż analiza płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.
[patrz też: fibroki allegro, endodoncja mikroskopowa kraków, rumia dentysta ]